無菌製劑容器密封性測試方法匯總

     無菌 藥品在使用前的無菌保證，是藥品管理法規的要求。因此，必須有容器完整性（Container Closure Integrity-CCI）的驗證和監測，以確保在無菌藥品生產(chan) ，質控，運輸和儲(chu) 存，乃至產(chan) 品有效期的整個(ge) 生命周期過程中，產(chan) 品不受微生物的汙染，確保病人用藥安全。目前各個(ge) 國家的藥政法規，都有提供容器完整性CCI的測試方法，但是沒有提供具體(ti) 細節，指導如何合理的選擇方法，及評價(jia) 一個(ge) 無菌藥品包裝係統( Container Closure System-CCS)的完整性。方法的合理選擇，以及科學的製定一個(ge) 可接受的標準，和產(chan) 品的性質和包裝係統密不可分。歐洲醫藥同盟多次開會(hui) 探討容器完整性測試的最佳方法，卻得出結論，並不存在容器完整性測試的一個(ge) 黃金標準，在考慮無菌製劑的既定用途和產(chan) 品設計的基礎上，需要采取一個(ge) 靈活的方法，來評估產(chan) 品的包裝容器完整性。

   美國藥典修訂了容器完整性測試（Container Closure Integrity Testing-CCIT）的通則方法USP<1207>。這個(ge) 修訂緣於(yu) 上世紀70年代的一個(ge) 醫療事故，當時美國雅培工廠的一個(ge) 靜脈輸注產(chan) 品的包裝係統做了更換，在醫院注射此產(chan) 品的病人廣泛爆發敗血症，導致10%的病人因此死亡，經調查證實更換的包裝係統存在密封完整性的缺陷，使產(chan) 品遭受微生物汙染。這個(ge) 悲劇事件，以及不斷提升的藥政監管要求，強調了製藥企業(ye) 確保無菌製劑包裝完整性的重要性。

方法簡介和選擇依據

   根據USP通則<1207>，將容器密封完整性測試的檢測方法分成確定性和概率性兩(liang) 種類型。確定性檢測方法包括：高壓泄漏檢測法，激光頂空分析，氦氣泄漏測試，質子流法，壓力衰減法，真空衰減法，和Corona電極放電法。概率性檢測方法包括：氣泡發射法，色水法，和微生物挑戰法。

   每個(ge) 方法有其不同的靈敏度以及選擇參考點。製藥企業(ye) 需要把包裝係統CCS作為(wei) 藥品開發的關(guan) 鍵質量屬性之一，用質量源於(yu) 設計（Quality by Design-QbD）的理念，在藥品設計到生產(chan) 的整個(ge) 生命周期內(nei) ，基於(yu) 不同階段藥品有不同的應用目的，選擇合適的、CCIT方法。在選擇CCIT方法的時候，必須充分理解內(nei) 包裝的材料特點，製作工藝參數，和操作中的控製方法。此外，對於(yu) 容器密封性的可接受標準，在不同的產(chan) 品發展階段也會(hui) 有所不同。

在選擇一個(ge) 合適的容器完整性測試CCIT方法的時候，需要考慮以下因素：

-     方法的既定用途，即，用於(yu) 包裝係統的開發和確認，還是商業(ye) 生產(chan) 階段的過程控製或驗證，還是穩定性測試；

-       包裝係統開發前的認知，即，是開發該產(chan) 品和包裝係統，還是改進一個(ge) 新產(chan) 品的包裝係統；

-       包裝係統的形式，即，小玻璃瓶，注射器，藥品和醫療器械的複合製劑，還是靜脈點滴用袋子；

-       包裝係統的材料，是延展性材料，玻璃，還是高分子聚合物；

-       藥品的類別，即，液體(ti) 製劑，凍幹粉製劑，小分子產(chan) 品，還是大分子產(chan) 品，水相製劑，溶劑製劑，還是油相製劑，產(chan) 品導電性如何，產(chan) 品黏度，頂空氣體(ti) 的組成，常壓，還是真空包裝，或是過壓包裝；

-       測試時間長短的考量；

-       要求的方法靈敏度；

-       樣本做人工泄漏的可行性和人工泄漏方式

-       用於(yu) 專(zhuan) 屬研究的樣本量；

-       樣本製備的考量，以及樣本製備帶來的潛在風險，比如需要移除標簽，或需要排空小瓶，或需要清潔小瓶。

在很多情況下，包裝密封性測試方法的最初選擇，是基於(yu) 某特定測試技術的經驗。隨著製藥企業(ye) 經驗的積累，類似產(chan) 品或包裝的參考，還有文獻的參考，以及行業(ye) 標準和指南文件的指導，在產(chan) 品開發到發展的整個(ge) 生命周期，會(hui) 采用不同的測試方法。在測試方法選擇上，還需要考慮以下因素：

・對測試樣本的破壞性還是非破壞性；

・測試的方法是內(nei) 聯，在線，離線，還是近線；

・測試的有效性考量，包括測試速度（比如單位時間內(nei) 的測試量），測試的產(chan) 出（包括樣本平衡的時間和控製組的測量）

・ 測試頻率和計劃：隻需要測試一次還是需要多次，比如需要在穩定性方案中測試（氣體(ti) 滲透的潛在影響）；

・測試成本，包括設備的購買(mai) ，方法和設備的驗證，測試條件的維護成本；

・用於(yu) 測試裝載的包裝係統，還是空載的包裝係統

・是否幹擾藥品的理化測試；

・方法操作的特點：靈敏度，方法的耐用性，精密度，和準確度；

・測試結果的表述方式：通過/失敗（即，判定是否存在超過方法靈敏度的泄漏），泄漏位置的標記，還是能定量的測出泄漏孔的大小或泄漏流量；

・ 泄漏樣品帶來的設備汙染風險。

  不管選擇哪個(ge) 測試方法，測試儀(yi) 器都需要經過校驗，測試方法也需要通過驗證，測試方法的係統適用性試驗，應該包括陽性控製（即已知泄漏的樣本）和陰性控製（即沒有人工泄漏的樣本）。

方法特點和應用範圍

下文將對各種常見測試方法的優(you) 缺點和應用範圍做詳細探討。

1）高壓泄漏檢測法

   High-voltage leak detection

這是一種確定性的泄漏測試方法。高壓電檢漏是基於(yu) 定量的電導測試，要求容器內(nei) 灌裝的液體(ti) 有一定的電導率，在待檢品上外加高壓電，泄漏點的存在導致樣品電阻的下降，從(cong) 而導致電流的突躍，當然這個(ge) 電流應該大於(yu) 預先確認的方法檢測閾值（通過/失敗判定的靈敏度）。

該方法的優(you) 點：

-       不需要破壞樣本

-       可以做到100%的在線測試

-       高速的測試

-       不需要測試前的樣品製備

-       其準確性獨立於(yu) 員工的操作技能

-       在常壓下測試

該方法的缺點：

-       隻有通過/失敗兩(liang) 種結果，沒有定量的結果

-       藥品本身的電導應該大於(yu) 包裝材料的電導

-       有可能破壞到產(chan) 品（比如引起蛋白質的降解）

-       製劑液體(ti) 必須不是易燃液體(ti)

-       測試過程會(hui) 產(chan) 生臭氧

-       對於(yu) 特定的包裝係統，需要的固定裝置

-       電極必須離泄漏點在一定的距離內(nei)

-       藥品液體(ti) 需要和泄漏點接觸或者非常靠近

-       產(chan) 品堵塞泄漏孔會(hui) 導致測試結果不準確

-       不適用於(yu) 凍幹粉製劑產(chan) 品

該方法的應用範圍和建議：

-       對於(yu) 商業(ye) 化生產(chan) 線的高產(chan) 出的檢測。

-       需要評估產(chan) 品接觸到高壓後的質量影響。

-       在長期穩定性樣品的泄漏測試上受限，這主要是由於(yu) 長期儲(chu) 存過程中液體(ti) 風幹堵塞泄漏孔。

-     產(chan) 品的電導可能不足以檢測出泄漏

-     可以把100%的在線檢測模式整合到自動目測檢查的生產(chan) 線中。

-       在100%的在線測試中依舊受到限製，這主要是由於(yu) 方法有其靈敏度，隻能測試到大於(yu) 靈敏度的泄漏。

-       當泄漏點在小瓶的頂端位置，比如在閘蓋處，沒有和液體(ti) 產(chan) 品接觸到，該方法就不適用。

2）激光頂空分析

   Laser-based headspace analysis

這是一種確定性的泄漏測試方法。激光法是通過監測容器頂空壓力、水汽和頂空氧變化來判定容器的完整性，原理是發射的激光穿透容器頂空，容器頂空的水汽和氧對激光有吸收，激光吸收量和對應的物質含量成正比。頂空水汽的吸收峰寬度和頂空壓力成正比，因此可以通過頂空水汽的吸收峰寬來獲得頂空壓力。

該方法的優(you) 點：

-       不需要破壞樣本

-       可以做到定量測試

-       可以做到100%的在線測試

-       高速率的測試

該方法的缺點：

-       包裝容器必須是透明的

-       需要在包裝瓶的頂空有可以改變的氣體(ti) 環境

-       需要頂空部位有一定的空氣體(ti) 積供於(yu) 檢測

-       在探測小尺寸的泄漏上，會(hui) 延長測試的時間

-    變更設備的部件時需要包含所有不同的尺寸和型號

該方法的應用範圍和建議：

-       對於(yu) 微米級孔徑大小的泄漏，測試可能需要耗時幾周的氣體(ti) 交換。

-       測試方法方便使用

-       可用於(yu) 評估瞬間發生的泄漏（比如測試需要低溫儲(chu) 存的產(chan) 品）

-       有可能導致錯誤的測試結果，尤其是在穩定性研究中，由於(yu) 氣體(ti) 的滲透或被液相吸收。

-       由於(yu) 快速的和環境壓力平衡，大尺寸的泄漏可能無法測出（比如測試低溫儲(chu) 存的產(chan) 品）。

-       不容易區別出不同尺寸的泄漏。

-       不容易甚至不能夠測試出在液麵下的泄漏，因此，隻適用於(yu) 預灌注注射器。

-       凍幹粉製劑產(chan) 品可能會(hui) 導致泄漏的堵塞。

-       有部分的壓力依賴於(yu) 溫度。

3）真空衰減法

   Vacuum decay

這是一種確定性的泄漏測試方法。真空衰減法是將包裝容器置於(yu) 專(zhuan) 門的測試腔體(ti) 內(nei) ，對測試腔體(ti) 抽真空，容器內(nei) 外壓差使得容器內(nei) 部氣體(ti) 通過漏孔泄漏進入測試腔體(ti) ，主機壓力傳(chuan) 感器監測到壓力的變化，將壓力變化值和參考值做比較，壓力增大說明存在泄漏，以判定容器密封完整性是否格。此方法的測試步驟包括：抽真空、保壓和測試。

該方法的優(you) 點：

-       不需要破壞樣本

-       可以做到100%的在線測試

-       高速率的測試和產(chan) 出

-       測試不會(hui) 影響生產(chan) 進度

-       有ASTM方法可供參考（ASTM-American Society for Testing and Materials）

-       可適用於(yu) 液體(ti) 和凍幹粉的製劑

-       可應用於(yu) 有色包裝瓶和貼好標簽的包裝瓶檢漏

該方法的缺點：

-       儀(yi) 器昂貴，每種包裝係統需要特定的儀(yi) 器腔體(ti)

-       產(chan) 品堵塞泄漏孔的情況下會(hui) 檢測不出泄漏

-       真空腔體(ti) 的準備至關(guan) 重要（濕度會(hui) 影響測試結果）

該方法的應用範圍和建議：

-       此方法適用性很廣，可用於(yu) 支持產(chan) 品開發，商業(ye) 化，以及穩定性研究各階段，包裝容器的密封性檢查。

-       適用於(yu) 液體(ti) 和凍幹粉的製劑。

-       可應用於(yu) 包裝器械的測試，和貼好標簽的包裝瓶檢漏。不過，相對於(yu) 未貼標簽的初級包裝，其檢測靈敏度是降低的。

-       隻限於(yu) 在線測試，並會(hui) 產(chan) 生假陽性結果（比如，當有滯留氣體(ti) 在閘蓋處時；或者受到濕度波動的影響時）。

-       方法開發研究表明，該方法對凍幹粉，預灌注液體(ti) 的注射器，和小容量瓶液體(ti) 製劑具有等同的靈敏度。

-       當應用於(yu) 液體(ti) 製劑時（黏度限製），鐳射穿孔的陽性控製樣本容易出現堵塞的情況；對預灌注注射器，細孔也很容易被蛋白質或矽油堵塞。

-       壓力變化和泄漏的尺寸，泄漏的速率有量級的相關(guan) 性。然而，無法區分泄漏是來自於(yu) 多個(ge) 泄漏小孔還是單個(ge) ，或者是包裝連接處的裂縫。

4）微生物挑戰法(浸入或氣溶膠挑戰)

   Microbial immersion or aerosol challenge

這是一種概率性的泄漏測試方法，此檢查通常與(yu) 模擬灌裝同時進行。通過按照模擬灌裝驗證方案進行培養(yang) 基模擬灌裝，然後進行壓塞軋蓋後，目檢合格，經已驗證的滅菌櫃滅菌後，將容器密封麵浸入到高濃度的菌液中，使樣品容器內(nei) 的培養(yang) 基充分接觸封口內(nei) 表麵，樣品的頸部及封口的外表麵應*浸泡在菌懸液中，浸泡一定時間後取出，定期培養(yang) 後檢查是否有微生物侵入，以確定容器密封係統的完整性。同時，需要做陽性對照試驗，確認培養(yang) 基的促生長能力。測試中通常會(hui) 運用真空或過壓的挑戰條件。

該方法的優(you) 點：

-       數十年來獲得廣泛應用。

-       是整個(ge) 行業(ye) 和法規熟識的做法。

-       可以與(yu) 模擬灌裝結合，同步進行。

-       對產(chan) 品特性的直接評價(jia) （即，確保容器密封性可以使產(chan) 品免受微生物汙染）。

該方法的缺點：

-       對樣品的破壞性。

-       隻有通過或失敗的結果，沒有定量測試。

-       不可能進行100%的樣本測試。

-       測試會(hui) 耗時數周。

-       需要比較多的勞動力。

-       隻能適用於(yu) 可以做培養(yang) 基罐裝的包裝係統。

-       可能會(hui) 導致假陽性或假陰性的結果；測試的靈敏度部分依賴於(yu) 分析員的操作技巧。

-    對於(yu) 微小瑕疵，測試具有隨機性。

-    不同國家地區，對於(yu) 培養(yang) 基，所用菌種和測試方法還沒有統一。

該方法的應用範圍和建議：

-       此方法的檢測限隨著以下因素波動：泄漏的大小，包裝材料，菌種，培養(yang) 基和挑戰條件。

-       一直被用來建立關(guan) 鍵的泄漏點（根據其泄漏的速率或大小）。

-       浸入法比氣溶膠挑戰法更普遍，方法條件更容易達到，有更好的重複性。

-       不使用真空或過壓的條件，自然放置幾周時間再檢查，更具有代表性，不過耗時。

-       如果使用真空或過壓的條件，可以加速測試，數小時內(nei) 就可以做檢查，這種方式可以代表運輸條件，減少測試時間。

5）染色浴法

   Dye ingress

這是一種概率性的泄漏測試方法。將密封容器*浸沒在染色浴中，也可在染色浴中加入表麵活性劑，對整個(ge) 測試腔體(ti) 進行抽真空。如果該容器有裂縫，空氣就會(hui) 從(cong) 瓶中溢出。然後解除真空，這時泄漏容器內(nei) 存在負壓，染色溶液會(hui) 從(cong) 裂縫中進入瓶內(nei) 部，再對測試腔體(ti) 加正壓，提高染色液的滲入性，通過分析員或儀(yi) 器目檢剔除變色的容器。

該方法的優(you) 點：

-       數十年來獲得廣泛應用。

-       有ASTM和ISO的標準方法。

-       是整個(ge) 行業(ye) 和法規熟識的做法。

-       基礎並且有效率。

-       可靈活應用，同時測試不同包裝容器的泄漏情況。

-       可以看出泄漏的位置。

-       泄漏位置可以在液相中。

該方法的缺點：

-       對樣品的破壞性。

-       隻有通過或失敗的結果，沒有定量測試。

-       不可能進行100%的樣本測試。

-       必須是透明的包裝係統，用於(yu) 目測判斷。

-       如果樣品體(ti) 積本身比較大，隻進入很少的染色水，有時不容易分辨出來。

-       對於(yu) 微小瑕疵，測試具有隨機性。

該方法的應用範圍和建議：

-       方法具有多用途，可以測試初級包裝和外包裝，用來支持產(chan) 品開發階段，商業(ye) 化生產(chan) ，和穩定性研究階段的檢漏測試。

-       直接檢測相關(guan) 泄露

-       可以運用不同的染色劑。

-       如果運用優(you) 化的真空/加壓循環工藝，可以提高測試的靈敏度。方法的檢測限隨著以下因素波動：泄漏的大小，包裝材料，染色液的濃度，和挑戰條件。

-       染色液必須是易混合的而且不和產(chan) 品發生化學反應。

-       可以把同樣的挑戰條件應用到微生物侵入試驗法中。

-       對於(yu) 液體(ti) 製劑應用良好，但基於(yu) 染色液的限製，可能對凍幹製劑不適合 。

人工穿孔的技術討論

上述討論的檢漏方法，都需要做方法驗證，需要有明確泄漏的樣本來做陽性控製，以挑戰方法的檢漏能力。對於(yu) 樣品的人工穿孔，有以下幾個(ge) 常用的方法：

-       鐳射穿孔，直接穿透包裝容器本身

-       鐳射穿孔，穿透在和包裝容器相連的金屬片或管 （laser drilling into a metal plate or tubing that is integrated to a CCS ）

-       微米級的金屬絲(si) 插入到容器中

-       微量吸管插入到膠塞或連接到容器的一個(ge) 人工小孔上

-       毛細管（熔融矽，鎳或玻璃）插入到膠塞或連接到容器的一個(ge) 人工小孔上。

每一種方法都有其挑戰性，包括穿孔尺寸的限製，穿孔形狀不規則，穿孔大小難以測量，微小穿孔容易被立即堵上，造價(jia) 高等等。目前行業(ye) 內(nei) 沒有標準來規定穿孔技術和孔徑測試的方法。在建立容器密封性測試方法的時候，每個(ge) 公司需要對自己建立的方法做合理性的說明，采用適當的方法。

結論

隨著修訂版USP<1207>的執行，對於(yu) 包裝容器密封性測試（CCIT）會(hui) 有更多深入的調查，生產(chan) 無菌製劑的企業(ye) 需要符合不斷發展的法規期望。對於(yu) CCIT的測試方法和可接受標準，目前行業(ye) 給予企業(ye) 一定的靈活性。正如上述討論，每個(ge) 方法都有其優(you) 缺點和適用性，市麵上的測試儀(yi) 器也有其各自的優(you) 缺點，因此，製藥企業(ye) 有責任根據產(chan) 品自身的特點和產(chan) 品的不同發展階段，采用風險評估的方法，選取並驗證合適的檢漏測試方法，並建立泄漏的可接受標準。

表1. 五種泄露檢測法綜合評價(jia)

表2. 五種泄露檢測法詳細描述